样本裂解30 min
RIPA 裂解液 + 蛋白酶抑制剂，冰上裂解 30 min，每 10 min 轻柔混匀。
关键控制点：全程保持 0–4℃
WESTERN BLOT · EXP-2026-0711-01
检测 HeLa 细胞中核蛋白 X 的表达
PROTOCOL v2.0 · Western blot
检测 HeLa 细胞中核蛋白 X 的表达
通过 Western blot 检测 HeLa 细胞裂解物中核蛋白 X 的表达。
操作步骤
蛋白定量35 min
使用 BCA 法测定浓度，设置标准曲线与空白对照。
关键控制点：样本落在标准曲线范围内
变性与上样10 min
每孔 30 μg 蛋白，加入 4× loading buffer，95℃ 5 min。
关键控制点：膜蛋白可改用 70℃
电泳75 min
10% SDS-PAGE；80 V 过浓缩胶，120 V 分离。
关键控制点：观察溴酚蓝前沿
转膜100 min
PVDF 膜甲醇活化；湿转 100 V，冰浴 90 min。
关键控制点：排尽膜与胶之间气泡
封闭与抗体孵育16 h
5% BSA 封闭 1 h；一抗 1:1000，4℃孵育过夜。
关键控制点：磷酸化蛋白避免奶粉封闭